Serviço de Sequenciamento

ACTGene Análises Moleculares LTDA

A ACTGene Análises Moleculares realiza sequenciamento de DNA a partir de produtos de PCR e plasmídeos utilizando o equipamento ABI-PRISM 3100 Genetic Analyzer. O tamanho da sequência obtida normalmente é de 700 pb.

É importante salientar que o usuário é o responsável pela qualidade e quantidade do DNA molde a ser fornecido. Por outro lado, a ACTGene tem o compromisso de trabalhar para que cada amostra submetida para sequenciamento produza uma sequência de alta qualidade e o mais longa possível.


Valores do Serviço de Sequenciamento de DNA:

• Amostras não marcadas com o reagente Big Dye- Applied Biosystems: R$ 22,00/amostra
• Amostras já marcadas com o reagente Big Dye- Applied Biosystems: R$ 15,00/amostra

Normas para encaminhamento de amostras não marcadas:

Em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL, adicionar 30 a 60 ng de DNA-molde (se for produto de PCR) ou 100 a 250 ng de DNA-molde (se for plasmídeo), mais 4,5 pmol de primer, em um volume final de 6 μl. Portanto, em cada tubo, coloque o DNA-molde na quantidade solicitada, um único primer e água ultrapura (Mili-Q) para completar um volume final de 6 μl.

As amostras de DNA-molde + primer podem ser secas em speed-vac ou, alternativamente, deixando-se o tubo aberto em estufa a 60 ^oC. Envie as amostras a nós pelos Correios normal ou Sedex, à temperatura ambiente. Iremos ressuspender as amostras em 6 mL de água ultrapura e proceder a marcação e sequenciamento.

Alternativamente, poderemos ceder microplacas de 96 poços para quantidades superiores a 50 amostras. Neste caso, em cada poço da microplaca deverão constar 3 mL de 15 a30 ng de DNA-molde (se for produto de PCR) ou 50 a 125 ng de DNA-molde (se for plasmídeo), mais 2,5 pmol de um único primer.

Poderemos realizar um teste com oito amostras suas antes de sequenciarmos um número maior. Não haverá custo para estas oito amostras.

Endereço para envio das amostras e formulário por Correio:

ACTGene Análises Moleculares

Rua Gustavo Valente, 69

Bairro Bela Vista

CEP 94810-250  Alvorada-RS

Fone:51-3044.3308/3483.3335

Endereço e Horário para entrega das amostras e formulário pessoalmente:

Campus do Vale da UFRGS, no Prédio Principal do Centro de Biotecnologia (Prédio 43.421) – Andar Inferior – Secretaria – Aos cuidados de Luciano

Horário para entrega de amostras: Diariamente, das 08:30 às 12:00h e das 13:00h às 17:00 h

Responsável pelo recebimento das amostras: Jordana - Tel. 3044.3308 – jordana@ludwigbiotec.com.br

Prazo para encaminhamento de resultados:

Submeteremos as amostras ao sequenciamento todas as sextas-feiras, desde que um mínimo de 48 amostras sejam recebidas. O prazo máximo para encaminhamento dos resultados (por e-mail) é de 15 dias.

Dúvidas técnicas:
Prof. Dr. Giancarlo Pasquali - Tel. 51- 3308.9410 - pasquali@cbiot.ufrgs.br
 

Perguntas Frequentes:

Os produtos de PCR precisam ser purificados?

Recomendamos que produtos de PCR sejam purificados de géis de agarose após eletroforese (GFX, freeze-squeeze ou a partir de tratamento enzimático), para evitar que outros produtos inespecíficos da PCR prejudiquem o resultado. Mesmo inespecíficos, estes produtos foram gerados pelo mesmo par de primers da reação. Se um destes primers for utilizado na reação de seqüenciamento, será gerada a seqüencia sobreposta de mais de um produto.

Porém, caso tenhas a certeza de que uma única banda é gerada na PCR e o consumo dos primers tenha sido ótimo, não necessitas purificar a amostra, apenas submetê-la na quantidade e acompanhada do primer adequado.

Para uma região de 1600 pb quantos primers são recomendados para que se obtenha uma sequência consenso de qualidade?

Sequenciamentos de amostras de boa qualidade (DNA-molde e primer) resultam em leituras de 800-1200 n. O sequenciamento em ambas as direções permitiriam, assim, o sequenciamento de 1.600 pb. Entretanto, somente a região central estaria presente em ambas as leituras, por sobreposição da região complementar.

Posso enviar os dois primers em um mesmo tubo?

Apenas um primer deve estar misturado ao DNA-molde por tubo. Caso dois primers estejam presentes, haverá a sobreposição dos eletroferogramas, isto é, dos resultados dos sequenciamentos das duas fitas do DNA-molde. Portanto, para cada produto de PCR (amplicon), dois tubos contendo os mesmos devem ser fornecidos. Em um constará o primer "forward", no outro o primer "reverse". Isto, é claro, se o sequenciamento de ambas as fitas é desejado.

Posso realizar o sequenciamento utilizando somente um primer?

Os sequenciamentos poderão, sim, ser realizados apenas com um primer (forward, p. ex.). As desvantagens óbvias são (I) de não ser possível obter a sequência da região de anelamento do próprio primer e de cerca de 5-10 nucleotídeos a jusante (downstream) dos mesmos; (II) não permitir a confirmação da sequência pela fita complementar; e (III) não se obter sequências além de 800-1.200 pb. Caso os fragmentos de PCR sejam curtos, esta última não é uma desvantagem

Em qual tipo de arquivo os resultados são enviados?

Arquivos txt (texto) e ab1 (eletroferograma), que pode ser lido em programa específico da Applied Biosystems (Sequencing Analysis) ou no Chromas, publicamente disponível.

As amostras enviadas por Correio precisam ser acondicionadas em gelo seco?

Não, as amostras podem ser enviadas a temperatura ambiente, desde que secas utilizando uma centrífuga concentradora (speed-vac) para secagem de DNA. Alternativamente, as amostras podem ser secas a 60 ºC em estufa por 20, 30 min.